Mutationer och deras konsekvenser

Mutationer omfattar bestående förändringar från enstaka nukleotider till hela kromosomer och kan vara neutrala, adaptiva eller sjukdomsorsakande beroende på genomisk position, molekylär mekanism, celltyp och genetisk kontext. Konsekvensen bestäms inte enbart av förändringens storlek utan av dess effekt på genuttryck, RNA-processning, proteinfunktion, gendos och klonal eller organismal fitness. Samma sekvensvariant kan därför vara letal i en kontext, ge lindrig sjukdom i en annan och sakna mätbar fenotyp i en tredje.

Definitioner, terminologi och mutationsnivåer

En mutation är en bestående förändring av nukleotidsekvensen i cellens genetiska material. För att en DNA-lesion ska bli en mutation måste förändringen undgå korrekt reparation och fixeras i sekvensen, vanligen genom replikation. Termen variant är kliniskt neutral och föredras ofta i genetiska laboratoriesvar, eftersom ordet mutation lätt uppfattas som liktydigt med sjukdomsorsakande förändring. En variant kan klassificeras som benign, sannolikt benign, av oklar signifikans, sannolikt patogen eller patogen.

DNA-skada avser däremot en kemisk eller strukturell lesion, exempelvis 8-oxoguanin, en pyrimidindimer eller ett enkelsträngsbrott. Skadan är inte i sig en sekvensförändring och kan repareras utan att någon mutation uppstår. RNA-redigering förändrar RNA efter transkriptionen utan att DNA-sekvensen ändras. En polymorfism är traditionellt en variant med relativt hög populationsfrekvens, ofta definierad som minst 1 %, men frekvensen säger inte i sig om varianten är funktionellt neutral.

Mutationer kan systematiseras efter storlek och struktur, men gränserna varierar mellan laboratorier, analysplattformar och databaser.

Begreppet punktmutation används vanligen om ett basutbyte men kan även omfatta insertion eller deletion av ett enda baspar. CNV definieras ibland från tiotals baspar och ibland först vid betydligt större segment. Klassificeringen måste därför alltid kopplas till den metod och referenssekvens som använts.

Hur mutationer uppkommer

Mutagenes börjar med antingen felinkorporering under DNA-syntes eller en DNA-lesion. Ett polymeras kan exempelvis sätta in fel nukleotid mittemot templatet. Om proofreading och mismatch repair inte korrigerar felet kvarstår en mismatch. Vid nästa replikationscykel fungerar båda strängarna som mallar: den ena ger ursprungssekvensen, medan den felaktiga basen styr syntes av ett nytt, komplementärt baspar. Först då är förändringen fixerad som mutation i en av dotterlinjerna.

Spontana polymerasfel uppkommer genom begränsningar i nukleotidselektionen, wobble-parning och sällsynta tautomera former. En tillfällig protonförskjutning kan ändra en bas vätebindningsmönster så att den parar med fel partner. Strängglidning uppstår när den nysyntetiserade strängen eller templatsträngen lossnar och återansluter förskjuten, särskilt i homopolymerer och mikrosatelliter. En loop i den nysyntetiserade strängen ger typiskt insertion, medan en loop i templatsträngen ger deletion.

DNA är kemiskt instabilt även utan yttre exponering. Depurinering, hydrolys av N-glykosidbindningen till adenin eller guanin, ger uppskattningsvis omkring 10 000–20 000 AP-ställen per däggdjurscell och dygn. Cytosindeaminering bildar uracil, som parar med adenin och kan ge C:G>T:A. Deaminering av 5-metylcytosin ger direkt tymin; eftersom T:G-mismatchen är svårare att känna igen än uracil i DNA är metylerade CpG-dinukleotider viktiga mutationshotspots.

Reaktiva syreföreningar från bland annat mitokondriell metabolism oxiderar baser. Guanin kan omvandlas till 8-oxoguanin, som kan para med adenin och därmed ge G:C>T:A-transversion. Exogena mutagener har karakteristiska verkningssätt: UV-strålning bildar cyklobutanpyrimidindimerer, joniserande strålning orsakar oxidativa lesioner och strängbrott, tobaksrökens polycykliska kolväten ger skrymmande DNA-addukter och alkylerande ämnen kan bilda exempelvis O6-alkylguanin som felparar med tymin.

Replikationsfidelitet och DNA-reparation

Replikationens precision byggs upp i flera led. Replicativa DNA-polymeraser väljer först nukleotid utifrån geometri och komplementaritet, med en ursprunglig felfrekvens omkring 10⁻⁴–10⁻⁵ per inkorporerad nukleotid. Polymerasets 3′→5′-exonukleasaktivitet flyttar en felparad 3′-ände till ett korrekturläsande centrum, exciderar nukleotiden och återför strängen till polymerascentrum. Postreplikativ mismatch repair, MMR, identifierar återstående felparningar och små indelloopar. Tillsammans sänker dessa system den slutliga felfrekvensen till cirka 10⁻⁹–10⁻¹⁰ per baspar och celldelning.

BER initieras av lesionsspecifika DNA-glykosylaser. NER känner i stället igen störningar i dubbelhelixens struktur och är central för reparation av UV-skador. Dubbelsträngsbrott repareras med HR, som vanligen är relativt exakt när systerkromatiden är tillgänglig, eller NHEJ, som är snabbare men kan förlora eller lägga till baser vid fogstället. Translesionspolymeraser förhindrar kollaps av replikationsgaffeln men kan introducera mutationer.

Defekt MMR ger mikrosatellitinstabilitet och en hypermuterad genotyp, kliniskt relevant bland annat vid Lynch syndrom och flera sporadiska tumörformer. Patogena varianter i proofreadingdomäner hos polymeras ε eller δ ökar substitutionsbördan kraftigt. Reparationsdefekten påverkar därmed både cancersusceptibilitet, tumörens mutationsspektrum och ibland dess känslighet för immunterapi.

Germline-, somatiska och mosaika mutationer

En konstitutionell variant finns i princip i individens alla kärnförande celler. Den kan vara nedärvd eller ha uppkommit de novo i en förälders könscell, under gametogenesen eller i det befruktade äggets första celldelningar. Den humana substitutionshastigheten i germlinjen är omkring 1,2 × 10⁻⁸ per baspar och generation, vilket vanligen motsvarar cirka 60–70 de novo-SNV:er per barn.

Antalet de novo-substitutioner ökar framför allt med faderns ålder, eftersom spermatogoniala stamceller fortsätter att dela sig och ackumulerar replikationsrelaterade förändringar. Moderns ålder är särskilt betydelsefull för kromosomal nondisjunktion och aneuploidi. En de novo-variant hos barnet innebär inte alltid låg återupprepningsrisk: om en förälder har gonadal mosaicism kan flera könsceller bära varianten trots negativ analys i blod.

Mutation efter zygotbildningen ger mosaicism, vars utbredning beror på tidpunkten och cellinjen. Somatisk mosaicism är begränsad till kroppsceller, gonadal mosaicism till könsceller och gonosomal mosaicism omfattar båda. Variantallelfrekvensen, VAF, kan ge stöd för mosaicism men påverkas även av provets cellblandning, kopietal och analyssensitivitet. En heterozygot konstitutionell variant har ofta VAF nära 50 % i diploid vävnad, medan en sen mosaik variant kan ligga långt lägre.

Somatiska mutationer kan vara vävnadsspecifika och undgå blodanalys. Klonal hematopoes innebär expansion av hematopoetiska kloner med förvärvade mutationer och kan misstolkas som germlinefynd eller cirkulerande tumör-DNA. Mitokondriella mutationer uppvisar ofta heteroplasmi, det vill säga en blandning av normala och muterade mtDNA-molekyler. Fenotypen uppstår när andelen muterat mtDNA passerar en vävnads- och energiberoende tröskel.

Basutbyten: transitioner, transversioner och mutationsspektra

Ett basutbyte kan klassificeras kemiskt. Transitioner sker inom samma basklass: A↔G mellan puriner eller C↔T mellan pyrimidiner. Transversioner sker mellan purin och pyrimidin: A↔C, A↔T, G↔C eller G↔T. Transitioner dominerar vanligen eftersom de lättare uppkommer genom tautomeri och deaminering, och eftersom utbytet stör dubbelhelixens geometri mindre.

Mutationsspektrumet kan kopplas till bakomliggande lesioner. Cytosin- eller 5-metylcytosindeaminering ger C>T, 8-oxoguanin ger typiskt G>T och UV-skada ger C>T samt tandemsubstitutionen CC>TT vid dipyrimidiner. Tobaksassocierade DNA-addukter ger ett spektrum rikt på transversioner, särskilt G>T. Vilken sträng som transkriberas och hur effektivt skadan repareras kan skapa strängasymmetri.

En substitutions betydelse bedöms numera i sin trinukleotidkontext, där även basen före och efter den muterade positionen anges. Återkommande förändringar vid särskilt mutabla motiv kallas hotspots. Genom att dekomponera tusentals somatiska mutationer i en tumör kan man identifiera mutational signatures, vilka speglar exempelvis UV-exponering, tobaksrök, APOBEC-aktivitet eller defekt DNA-reparation.

Insertioner, deletioner och repetitiva sekvenser

Små insertioner och deletioner benämns gemensamt indels. I en kodande sekvens blir förändringen in-frame om nettolängden är delbar med tre; då läggs en eller flera aminosyror till eller tas bort utan att den fortsatta läsramen ändras. Om nettolängden inte är delbar med tre uppstår en frameshift, som förändrar alla efterföljande kodon och ofta introducerar ett prematurt stopp.

Homopolymerer och mikrosatelliter är särskilt känsliga för polymerasglidning. Expansion eller kontraktion av korta motiv korrigeras normalt av MMR; vid MMR-brist ansamlas längdvariationer och mikrosatellitinstabilitet. Repetitiva och GC-rika regioner är samtidigt tekniskt svåra eftersom korta sekvensläsningar kan mappas till flera genompositioner och GC-extremer kan ge ojämn amplifiering och låg täckning.

Dynamiska repeatexpansioner kan öka mellan generationer och orsaka anticipation, det vill säga tidigare debut eller svårare sjukdom i senare generationer. Effekten beror på motiv och position: expansion i kodande sekvens kan ge en lång polyaminosyrasträcka, medan introniska eller UTR-lokaliserade expansioner kan ge toxiskt RNA, metylering eller transkriptionshämning. Retrotransposoner kan dessutom infogas i exoner eller regulatoriska regioner och därmed avbryta genfunktion eller förändra splitsning.

Kopietalsförändringar och strukturella genomvarianter

Strukturella varianter omfattar deletioner, duplikationer, inversioner, insertioner och translokationer samt ringkromosomer, isokromosomer och komplexa rearrangemang. De uppkommer bland annat genom non-allelic homologous recombination, där likartade repetitiva sekvenser på olika genompositioner felaktigt rekombinerar, genom felaktig sammanfogning av dubbelsträngsbrott eller genom replikationsbaserade mallbyten.

Fenotypen kan bero på ändrad gendos, på att en gen bryts, på fusion av två gener eller på att en gen flyttas bort från sina regulatoriska element. En cytogenetiskt balanserad translokation innebär ingen uppenbar nettoförlust eller nettovinst av DNA men kan ändå vara sjukdomsorsakande. Bärare kan dessutom bilda obalanserade gameter och ha ökad risk för infertilitet, missfall eller barn med segmentell monosomi eller trisomi.

Strukturella varianter ska skiljas från numeriska kromosomavvikelser. Aneuploidi innebär avvikande antal enskilda kromosomer, exempelvis monosomi eller trisomi, medan polyploidi innebär extra kompletta kromosomuppsättningar. Dessa tillstånd påverkar ett stort antal geners dos samtidigt och får därför ofta breda utvecklingsmässiga konsekvenser.

Mutationer i proteinkodande sekvens

Den degenererade genetiska koden innehåller 64 kodon för 20 aminosyror och translationsstopp. Därför kan olika basutbyten få helt olika följder. En synonym variant ändrar kodonet men inte aminosyran; en missensevariant ersätter en aminosyra; en nonsensevariant skapar ett prematurt stoppkodon. In-frame-indels lägger till eller tar bort hela aminosyror, medan frameshiftvarianter förändrar den fortsatta aminosyrasekvensen.

Start-loss förstör normalt initieringskodon och kan minska eller eliminera translation, alternativt tvinga fram start från ett nedströms AUG. Start-gain skapar ett nytt potentiellt startkodon, ofta i 5′-UTR, och kan ge en förlängd produkt eller en upstream open reading frame som hämmar translation från ordinarie start. Stop-loss förstör stoppkodonet och förlänger proteinets C-terminal tills ett nytt stopp nås.

En synonym variant är inte nödvändigtvis funktionellt tyst. Den kan skapa eller förstöra splice-element, ändra mRNA:s sekundärstruktur, påverka kodonanvändning och translationshastighet eller förändra mRNA-stabiliteten. Nonsense- och frameshiftvarianter kan utlösa nonsense-mediated mRNA decay, NMD. En praktisk huvudregel är att ett prematurt stopp mer än cirka 50–55 nukleotider uppströms den sista exon–exon-övergången ofta medför NMD; sena stopp kan däremot undgå övervakningen och ge ett trunkerat protein.

Icke-kodande, regulatoriska och splitsningspåverkande mutationer

Icke-kodande DNA omfattar funktionella element som promotorer, enhancer- och silencerregioner, insulatorer, introner och UTR. En promotorvariant kan ändra bindning av transkriptionsfaktorer eller basal transkriptionsapparat. Enhancervarianter kan påverka genuttryck över stora genomiska avstånd och ge felaktig vävnads-, utvecklings- eller tidsstyrning utan att den kodande sekvensen förändras.

Splitsning kräver korrekt igenkänning av 5′-donor, 3′-acceptor, branch point och polypyrimidinsträcka samt samspel med exona och introna splicing-enhancers och -silencers. En variant kan orsaka exon skipping, aktivering av ett kryptiskt splice site, intronretention eller partiell användning av flera splice sites. Följden blir ofta frameshift och NMD, men kan också vara en in-frame-förlust av en proteindomän eller ändrad isoformbalans.

Varianter i 5′-UTR kan påverka ribosomrekrytering och translationsinitiering. Förändringar i 3′-UTR kan störa bindningsställen för mikro-RNA eller RNA-bindande proteiner och därmed ändra mRNA-stabilitet och translation. Mutationer i polyadenyleringssignalen kan ge felaktig klyvning eller förlängd 3′-ände. Även gener för icke-kodande RNA kan påverkas, med konsekvenser för kromatinreglering, RNA-processning och posttranskriptionell genkontroll.

Molekylära och cellulära funktionskonsekvenser

Alleler kan klassificeras efter funktionell effekt. Loss-of-function innebär minskad eller förlorad funktion; en hypomorf allel har residualfunktion och en amorf allel saknar i princip funktion. Gain-of-function innebär ny eller ökad aktivitet; hypermorfa alleler förstärker normal funktion och neomorfa alleler skapar en ny funktion. En dominant-negativ produkt stör den normala produkten, ofta genom att ingå i samma multimer eller komplex.

Konsekvensen av en missensevariant beror på proteindomän, evolutionär konservering och skillnaden mellan aminosyrornas laddning, storlek, polaritet och hydrofobicitet. Varianten kan ändra veckning, termodynamisk stabilitet, katalys, ligandbindning, oligomerisering, posttranslationell modifiering eller subcellulär lokalisering. Den kan också skapa ett degron eller förhindra korrekt transport, så att ett i övrigt aktivt protein bryts ned eller hamnar i fel organell.

Felveckade proteiner kan aggregera eller ansamlas i endoplasmatiskt retikel. Detta aktiverar unfolded protein response via bland annat IRE1, PERK och ATF6, med minskad translation, ökad chaperonproduktion och förstärkt proteinnedbrytning. Om proteostasen inte återställs kan signaleringen övergå i apoptos. Andra mutationer ger konstitutiv receptorsignalering, utebliven apoptos eller tillväxtfördel och kan därmed selekteras klonalt.

Från genotyp till fenotyp

Vid haploinsufficiens räcker en fungerande allel inte för normal funktion, vilket kan ge autosomalt dominant sjukdom. Dominant-negativa alleler påverkar funktionen från den normala allelen. Autosomalt recessiva tillstånd kräver vanligen biallelisk funktionsnedsättning, men sjukdomsgraden påverkas av om allelerna är amorfa eller lämnar residualfunktion. Hos män uttrycks X-bundna varianter hemizygot eftersom endast en X-kromosom finns.

Mitokondriella varianter nedärvs maternellt, men fenotypen påverkas av heteroplasmi, mitotisk segregation och vävnadernas energibehov. En patogen allel kan samtidigt ge heterozygotfördel: HbS-allelen medför sjukdom vid bialleliskt tillstånd men skyddar heterozygota bärare delvis mot svår malaria, vilket upprätthåller en balanserad polymorfism i vissa populationer.

Penetrans anger andelen variantbärare som utvecklar fenotypen, medan expressivitet beskriver fenotypens grad och spektrum. Pleiotropi innebär att en gen påverkar flera organsystem. Allelisk heterogenitet betyder att olika varianter i samma gen ger samma eller överlappande tillstånd; locusheterogenitet att varianter i olika gener ger liknande fenotyp.

Genetiska modifierare, epistas, miljö, imprinting och X-inaktivering kan kraftigt ändra utfallet. Somatisk mosaicism kan begränsa eller förvärra sjukdomen beroende på vilka vävnader som bär varianten. Sällsynta återgångsmutationer eller kompenserande sekundärmutationer kan återställa läsram eller funktion i en cellklon och ge segmentell fenotypisk förbättring.

Patogena mutationer: mekanistiska sjukdomsexempel

Sicklecellssjukdom illustrerar hela kedjan från SNV till organsjukdom. Varianten HBB p.Glu6Val ersätter en negativt laddad, hydrofil glutaminsyra med hydrofobt valin i β-globin. På deoxygenerat HbS skapas därmed en hydrofob kontaktyta som interagerar med andra hemoglobinmolekyler. HbS polymeriserar till långa fibrer, erytrocyten deformeras och membranet skadas.

Upprepade sicklingscykler minskar erytrocytens flexibilitet och livslängd, vilket ger kronisk hemolys och anemi. Stela erytrocyter, endotelaktivering, inflammation och ökad celladhesion bidrar till mikrovaskulär ocklusion med smärtkriser, ischemi och kumulativ organskada. Sjukdomen är autosomalt recessiv, men fenotypen modifieras bland annat av mängden fetalt hemoglobin.

Andra variantklasser ger sjukdom genom kvantitativ förlust av protein. Nonsense-, frameshift- och splicevarianter i HBB kan minska eller eliminera β-globinsyntes och orsaka β-talassemi; residualproduktionen avgör delvis svårighetsgraden. Bialleliska varianter i HEXA ger brist på β-hexosaminidas A, lysosomal ansamling av GM2-gangliosid och Tay–Sachs sjukdom.

Vid neurofibromatos typ 1 orsakar heterozygot funktionsförlust i NF1 minskad neurofibrominaktivitet och otillräcklig negativ reglering av RAS. Tillståndet är autosomalt dominant och uppvisar uttalad variabel expressivitet. Hemofili A orsakas av varianter i X-kromosomens F8; män blir hemizygot drabbade, och residual aktivitet av faktor VIII korrelerar med blödningsfenotypen. Stora inversioner, nonsensevarianter och vissa frameshiftvarianter ger ofta svårare faktorbrist än hypomorfa missensevarianter.

Somatiska mutationer och cancer

Somatiska mutationer i tumörer delas funktionellt i drivers, som ger selektiv tillväxtfördel, och passagerare, som följer med utan väsentlig effekt på maligniteten. Aktiverande mutationer i onkogener är ofta heterozygota och fokala, medan tumörsuppressorgener vanligen inaktiveras genom två genetiska eller epigenetiska händelser. Den andra händelsen kan vara mutation, deletion, promotorhypermetylering eller loss of heterozygosity, LOH.

KRAS-mutationer i kodon 12 stör GTPashydrolys och håller RAS-signalering aktiv. BRAF p.Val600Glu efterliknar aktiverande fosforylering och ger konstitutiv MAPK-signalering. Återkommande TP53-missensevarianter i DNA-bindningsdomänen minskar transkription av gener för cellcykelstopp, reparation och apoptos; vissa mutanta p53-proteiner kan dessutom ha dominant-negativa eller nytillkomna funktioner.

Reparationsdefekter ökar den genetiska variation som klonal evolution verkar på. Subkloner konkurrerar, och behandling selekterar de celler som redan bär eller senare förvärvar resistensmutationer. Därför kan primärtumör och metastaser, eller olika områden i samma tumör, ha skilda genotyper. Ett negativt fynd i en biopsi utesluter inte en relevant subklon på annan plats.

Tumöranalys måste tolkas utifrån tumörrenhet, lokalt kopietal och VAF. Låg VAF kan bero på låg tumörandel eller subklonalitet, men också på tekniska artefakter. Hög VAF kan spegla LOH eller amplifiering snarare än germlineursprung. Matchat normalprov kan behövas för att skilja somatiska förändringar från konstitutionella varianter och klonal hematopoes.

Evolution, varianttolkning och laboratorieanalys

Mutationer är råmaterial för evolution. Neutrala varianter kan ändra frekvens genom genetisk drift, skadliga varianter avlägsnas genom renande selektion och gynnsamma varianter kan öka genom positiv selektion. Antibiotikabehandling selekterar resistenta bakteriekloner men framkallar inte målmedvetet den relevanta mutationen. Heterozygotfördel kan upprätthålla alleler trots allvarlig homozygot fenotyp.

Hos vissa svampar är repeat-induced point mutation, RIP, ett premeiotiskt genomförsvar mot repetitivt DNA och transposoner. Duplicerade sekvenser utsätts för täta C:G>T:A-transitioner och blir ofta AT-rika och inaktiva. Mekanismen skiljer sig från slumpmässig mutagenes genom att den riktas mot repetitiva, homologa sekvenser.

Varianter beskrivs enligt HGVS med referenssekvens och nivå, exempelvis c. för kodande DNA och p. för protein. Referenstranskript måste anges eftersom exonnumrering, kodonposition och förutsagd konsekvens kan skilja mellan isoformer. ACMG/AMP-systemet använder fem klasser:

Bedömningen väger samman populationsfrekvens, segregation, de novo-status, alleltyp, funktionella studier, fenotypspecificitet och beräkningsprediktioner. In silico-resultat är stödjande men sällan ensamt avgörande. En VUS ska normalt inte användas som säker grund för prediktiv testning eller irreversibla kliniska åtgärder, och kan behöva omklassificeras när ny evidens tillkommer.

Vanliga felkällor är låg täckning, allelic dropout, pseudogener, homologiska regioner, GC-bias och felaktig mapping. Blodprov kan ge missvisande resultat vid klonal hematopoes, transfusion eller hematologisk malignitet. Ett genetiskt fynd måste därför bedömas tillsammans med metodens validerade detektionsgräns, provmaterial, fenotyp, familjeanamnes och vid behov verifieras med en ortogonal metod.

Källor

• Point mutation
• Punktmutation
• Category:Point mutation
• Point mutation
• Bild: File:Adenine-Thymine tautomers.png — Phacelias, CC BY-SA 4.0
• Bild: File:Point Mutation.jpg — NCI, Public domain
• Bild: File:Point mutations and their effect on DNA.jpg — Hullo97, CC BY-SA 4.0
• Bild: File:Point mutations-en.svg — User:Mikey641, CC BY-SA 4.0
• Bild: File:Missense Mutation Example.jpg — U.S. National Library of Medicine, Public domain